原核表达系统选型与避坑：T7启动子、DE3菌株和IPTG条件优化

简介：围绕原核表达实验流程整理的这份 doc 文档，面向分子生物学方向的研究生与实验人员，重点解决目的蛋白在大肠杆菌中表达效率偏低、可溶性差、质粒不稳定等常见困扰。文档以 Novagen 的 pET 系列载体与 T7 噬菌体转录系统为主线，讲清 T7 RNA 聚合酶驱动高水平转录的原理、DE3 溶源菌（BL21(DE3)、HMS174(DE3)）与 IPTG 化学诱导之间的调控关系，并逐项说明起始密码子的取舍、用 GST/Trx/NusA 融合标签改善溶解度、二硫键形成与周质空间信号序列等选型思路。对 LIC 不依赖连接克隆、pETcoco 低拷贝控制与 trfA 诱导放大拷贝数、pLysS/pLysE 抑制本底表达等技巧也有交代，还按蛋白酶缺陷、lacY1 突变、gor/trxB 缺陷、稀有密码子补给、硒代蛋氨酸标记等类别梳理宿主菌差异，并给出包涵体与蛋白折叠问题的调整策略。整包为 1 个 doc 文件，约 73KB，已有 87 人学习下载，适合作为载体与菌株选型的速查参考。

1. 从一块空白的胶图说起：原核表达难在哪

「克隆对了、双酶切对了、测序也对了，跑完 SDS-PAGE 却是一片空白」——做原核表达的人几乎都撞过这堵墙。说白了，原核表达就是把一个外源基因塞进大肠杆菌，让细菌替你造蛋白；工具是一套表达载体加一株配套宿主菌，最常见的组合是 T7 启动子载体配 DE3 溶源菌。它适合想快速拿到几十毫克级蛋白、做抗体制备、晶体筛选、酶学表征的人；不适合指望它给你补上糖基化和复杂翻译后修饰。下面按「系统怎么调控 → 载体菌株怎么配 → 引物怎么设计 → 翻车怎么查 → 条件怎么收口」走一遍，能抄的部分我都落成表格和脚本。

2. T7 系统的三个开关：启动子、聚合酶、溶菌酶

很多人卡在表达这一步，反复回头重做克隆，其实问题出在没搞清 T7 系统的分工。这套系统的精髓是「启动子」和「聚合酶」被拆到了两个地方：启动子留在质粒上，聚合酶藏在宿主染色体里。谁提供启动子、谁提供聚合酶、谁来压制不加诱导剂时的泄漏，这三个问题想通了，载体和菌株的选择就不用背表，直接推。

2.1 强启动子为什么能把宿主资源抢干净

T7 RNA 聚合酶的专一性极高，只认 T7 启动子，不认大肠杆菌自己的启动子；它的合成速度大约是大肠杆菌 RNA 聚合酶的 5 倍，还能转录一些宿主酶根本读不动的序列。当细胞里同时存在 T7 RNA 聚合酶和 T7 启动子时，宿主自身基因的转录竞争不过它，几乎全部资源被调去表达目的基因——诱导几个小时后，目的蛋白常常能占到细胞总蛋白的一半以上。这个「抢资源」的特性是它最大的优势，也是它最大的坑：转录太快，翻译出来的肽链来不及折叠，直接堆成不溶的包涵体。所以要可溶，往往得反着来，选弱一点的启动子或者把诱导条件压下去。

表里最右边一列是我自己的用法习惯：常规可溶表达优先 25 ℃ 配低浓度 IPTG 走 T7，毒性明显或者要精确控制剂量就换 pBAD 这类可调启动子。温控载体看起来省了诱导剂的钱，实际操作里升温和降温都慢，而且热激本身会诱导一批蛋白酶，产物稳定性反而更差，我一般只在发酵罐上考虑。

2.2 DE3 溶源菌：T7 RNA 聚合酶到底从哪来

大肠杆菌自己不带 T7 RNA 聚合酶基因，所以必须由宿主提供。常见的做法是把 λ 噬菌体衍生株 DE3 溶源化进宿主染色体：一段含 lacI、lacUV5 启动子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 插在 int 基因里。平时 lacI 产物压着 lacUV5，聚合酶几乎不表达；加 IPTG 后阻遏解除，聚合酶开始合成，再去驱动质粒上的 T7 启动子。

这个结构推出三条硬结论，值得贴在实验记录本第一页：第一，表达质粒必须进带 DE3 的菌，进普通克隆菌只会扩增质粒，什么都不会表达；第二，调控是双层的，IPTG 先控制聚合酶的产量，聚合酶产量再决定目的基因的转录强度，所以 IPTG 浓度不只是开关，还是音量旋钮；第三，因为第一层有泄漏，不加 IPTG 时也可能有微量聚合酶，这就是后面要处理的本底表达来源。

还有两条替代路线，知道即可，日常很少用：一条是用带温敏突变和 PL/PR 控制聚合酶基因的 λ 噬菌体去侵染宿主，热诱导提供聚合酶；另一条是共转化一个表达 T7 RNA 聚合酶的质粒，甚至有人用溶氧响应型启动子来控制聚合酶，据说更适合工业发酵的过程控制。少数特殊场景才值得折腾。

2.3 三道阀门：把不加诱导剂时的泄漏压下去

本底表达是毒性蛋白和质粒不稳定的头号杀手。所谓本底，就是没加 IPTG 时那点漏出来的聚合酶已经足够启动转录，产物一边毒害细胞一边让质粒被淘汰，最后你筛到的克隆全是重排过的。压制手段有三道，可以叠加。

第一道在载体上：带 T7lac 启动子的载体，在紧邻 T7 启动子下游放了一段 lacI 操纵子序列并表达 lacI 阻遏蛋白。这个阻遏蛋白同时作用于宿主染色体上驱动聚合酶的 lacUV5 和载体上的 T7lac，等于两头一起掐。第二道在宿主里：共转化表达 T7 溶菌酶的辅助质粒，溶菌酶直接结合并抑制 T7 RNA 聚合酶。常见的两个版本差别不小——低表达的那个对细胞生长影响小，高表达的那个抑制更彻底，但会明显拖慢宿主生长，诱导后滞后时间变长，表达量反而掉下来，属于典型的过度调节。第三道在培养基里：加葡萄糖压制本底，这是实验室里流传很久的经验做法，不同人效果不一，我一般只在毒性蛋白上试。另外，高拷贝质粒配超强启动子本身就是泄漏放大器，真压不住就换低拷贝载体，比反复加抗生素靠谱。

3. 载体与菌株配型：从 N 端到稀有密码子的选型表

表达失败的锅，一半在选型阶段就埋下了。我自己总结的选型顺序是四个问题：N 端要不要留多余残基、要不要可溶、质粒稳不稳、密码子偏不偏。四个问题对应四组元件，一次定完，后面基本不用再换。

3.1 先定 N 端：用载体的 ATG 还是基因自己的 ATG

如果不在乎 N 端多几个氨基酸，直接用载体的起始密码子最省事：读码框现成，酶切位点选在 MCS 里，克隆进去就能表达。载体上通常已经优化过起始密码子到核糖体结合位点的距离，不需要自己再调。

要在 N 端一个多余残基都不留，常规做法是用 NdeI（CATATG）把起始密码子卡在酶切位点里，ATG 同时充当载体和目的基因的起始密码子。这条路干净，但要先确认目的基因内部没有 NdeI 位点，有的话要么换同义密码子突变掉，要么改成 C 端融合、表达后再用肠激酶或 TEV 之类的位点把标签切掉。三种方案的取舍我列在下面：

3.2 可溶性的三条路：融合伴侣、二硫键、周质分泌

外源蛋白在大肠杆菌里不加干预，大概率以不溶的包涵体形式出现。想拿可溶产物，原文给的三条策略到今天依然是主流。

一是挂一个高度可溶的多肽一起表达，比如 GST、硫氧还蛋白 Trx、NusA，还有 MBP 这类。伴侣越大，抗聚集能力越强，但占的分子量也越夸张。二是转入能催化二硫键形成的酶或改造宿主，比如 Trx、DsbA、DsbC，配合后面要讲的 gor/trxB 缺陷菌株，对含二硫键的蛋白帮助明显。三是在起始密码子和目的基因之间插一段信号肽，把产物导到细胞膜和细胞壁之间的周质空间，那里氧化环境更适合二硫键形成，产物是可溶的活性状态，还省了复性。

标签大小怎么配，我的经验是反着来：分子量很小的蛋白（低于 10 kDa）挂个大标签（GST 约 26 kDa），既帮忙折叠又防降解，做抗原时免疫原性也更好；分子量大的蛋白（60 kDa 以上）反过来用小标签，6×His 最合适，对折叠干扰小。His 标签还有个现实优势——纯化填料和抗体都便宜好买。这一点吃过亏：早年给一个蛋白挂了小众标签，等到做 Western 鉴定才发现对应的单抗又贵又难订，纯化还得单独配填料，省下的克隆时间全赔进去了。

3.3 宿主菌株的六个改造方向与对应场景

菌株是最容易被忽视的一环。市面上能买到的表达菌株大多是围绕 BL21 做的定向改造，每一类改造对应一类具体问题，选之前先问自己卡在哪。

Tuner 这一类的思路值得单独说：它是 BL21 的 lacY1 缺失突变型，乳糖渗透酶坏了，IPTG 进入每个细胞的量变得均一，于是蛋白表达浓度能跟着 IPTG 浓度线性走。低浓度表达有利于可溶性和活性，高浓度追求产量，同一个菌株就能覆盖两端。Rosetta 系列则是在 BL21 lacY1 背景上再加一个氯霉素抗性的辅助质粒，提供 AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA 这几种大肠杆菌里偏稀有密码子的 tRNA。这里有个常见翻车点：如果你的表达质粒本身是氯霉素抗性，就没法再用氯霉素去压 Rosetta 的辅助质粒，整套筛选逻辑直接崩掉，选载体时一定要把抗性组合先对齐。

3.4 双表达与低拷贝：多基因共表达和毒性蛋白的两条出路

要同时表达两个蛋白，可以用双 MCS 的载体：两个多克隆位点、两套 T7 启动子、乳糖操纵子和核糖体结合位点各自独立，一个质粒装两个基因。配套不同复制子的载体共转化，最多能同时表达八个外源蛋白。共转化的前提是复制子相容——pBR322 衍生的、CloDF13 衍生的、RSF1030 衍生的、ColA 衍生的这几类可以在同一细胞里共存，同源复制子的两个质粒放一起必然有一个被挤掉。

毒性强的蛋白还有一条路是低拷贝载体。这类载体引入 F 附加体上的 oriS 和 repE 元件，配合 parABC 维持单拷贝，质粒稳定、对细胞压力小；需要放量时加阿拉伯糖诱导 trfA 基因表达，拷贝数升到 25–50，再加 IPTG 诱导表达，表达量能拉起来。代价是操作步骤多了一步，诱导时机比常规载体讲究。

4. 引物设计与克隆：把读码框、酶切位点、保护碱基一次算对

设计引物这一步，做全长表达其实要考虑的不多：一头一尾各取至少 8 个匹配碱基，加上和载体匹配的序列就够了。但恰恰是这几个多余的碱基，决定了后面两个月的返工量。我一般先做序列体检，再动引物。

4.1 表达前的序列体检：五个指标先过一遍

顺序是这样：翻译起始位点、GC 含量、起始区二级结构、基因或蛋白大小、亲疏水性。翻译起始位点大多数载体已经优化好，只需确认载体图谱上标明了起始密码子和终止密码子，别拿到一个不标终止子的载体还在疑惑为什么表达量低。

GC 含量超过 70% 的时候，大肠杆菌里的表达水平可能明显下降；起始密码子附近的 mRNA 二级结构会抑制翻译起始或者造成翻译暂停，产生不完整产物，如果分析发现有茎结构且配对长度超过 8 个碱基，这个结构就不稳定，容易出问题。大小方面，低于 5 kDa 的蛋白特别容易被降解，高于 100 kDa 的表达难度陡增，60 kDa 以上就建议用小标签了。疏水性同理：亲水区段表达量普遍高，膜蛋白要做好长期抗战的准备，跨膜区可以用在线预测工具先扫一遍。

这套检查完全可以脚本化，跑一遍比翻软件点半天快：

import re # 按你载体 MCS 上的位点补全，这里列的是最常撞车的几个 SITES = { "NdeI": "CATATG", "XhoI": "CTCGAG", "BamHI": "GGATCC", "EcoRI": "GAATTC", "HindIII": "AAGCTT", "NotI": "GCGGCCGC", "SalI": "GTCGAC", "XbaI": "TCTAGA", "SacI": "GAGCTC", } # 大肠杆菌中偏稀有的一组密码子（DNA 形式） RARE = {"ATA", "AGG", "AGA", "CTA", "CCC", "GGA"} def audit_cds(raw, frame0=0, gc_window=30, rare_run=3): """raw: 目的基因 CDS 序列；frame0: CDS 第一个碱基在序列中的偏移""" s = re.sub(r"[^ACGT]", "", raw.upper()) if len(s) % 3 != 0: print("警告：长度不是 3 的倍数，检查是否混入了载体序列") gc = 100 * (s.count("G") + s.count("C")) / len(s) print(f"长度 {len(s)} bp / 约 {len(s)//3 - 1} aa / GC {gc:.1f}%") # 1. 内部酶切位点查重：决定引物上能加哪些位点 for name, site in SITES.items(): pos = [m.start() + 1 for m in re.finditer(site, s)] if pos: print(f" 内部 {name} 位点：{pos}") # 2. 稀有密码子分布，连续出现才是真麻烦 flags = [1 if s[i:i+3] in RARE else 0 for i in range(frame0, len(s) - 2, 3)] hits = [(frame0 // 3 + i + 1, s[frame0 + 3*i: frame0 + 3*i + 3]) for i, f in enumerate(flags) if f] streak, worst = 0, 0 for f in flags: streak = streak + 1 if f else 0 worst = max(worst, streak) print(f" 稀有密码子 {len(hits)} 个，最长连续 {worst} 个（阈值 {rare_run}）") print(f" 前 12 个位置：{hits[:12]}") # 3. 起始密码子附近 GC，过高容易形成稳定二级结构 start = s[max(0, frame0 - gc_window): frame0 + gc_window] if start: g = 100 * (start.count("G") + start.count("C")) / len(start) print(f" 起始区 ±{gc_window} nt 的 GC：{g:.1f}%") # 用法：把测序确认过的 CDS 粘进来，人工去掉首尾载体序列后 frame0 填 0 # audit_cds("ATGAGC...TAA")

脚本里三个参数值得改：frame0用来对齐 CDS 起点，如果你直接粘的是含酶切位点的扩增片段，就要把起点偏移填进去，否则稀有密码子统计会整体错位；gc_window控制起始区窗口大小，默认前后各 30 nt，想看得更宽就调到 45；rare_run是连续稀有密码子的告警阈值，我一般设 3，连续三个以上就考虑直接上 Rosetta 类菌株，而不是先试 BL21 再说。位点部分按你载体 MCS 的实际酶补全，别只跑默认这九个。

4.2 引物上的五个细节，一个都别省

第一，先查目的片段内部有哪些酶切位点。这一步最容易漏，漏了的后果是酶切鉴定时老是出现比预期小的片段，你还以为是部分酶切，其实是自己的基因被切开了。

第二，保护碱基。酶切位点 5' 端不加保护碱基，内切酶切不动，连接效率低到怀疑人生。不同酶要求不一样，SalI 可以不加，EcoRV 要 1 个，NotI 要 2 个，HindIII 最好给 3 个。拿不准就统一设计 2 个，具体以厂商的酶切效率表为准。

第三，读码框和终止密码子。载体上有 ATG 就不用另外加，但 ATG 之后往往不是紧接着外源片段，中间那段载体序列一定要逐碱基核对会不会造成移码，必要时在引物里加 1–2 个碱基把框拨正。大多数载体自带终止密码子，不放心就在下游引物里再设计一个，多写三个碱基的事，能省掉一轮排查。

第四，引物本身的物性。一对引物 Tm 差得越小越好，避免发夹结构和互相配对，尤其别出现 G-C 配对的二聚体，3' 端以 G 或 C 结尾更稳。另外一条老被忘：上游引物写成有义链，下游写成反义链，写反了什么片段都扩不出来。

第五，做截取表达时，除了挑亲水区段，还要看密码子使用频率。如果外源片段里连续出现大肠杆菌少用的密码子，尽量避开那个边界，换一段截。

4.3 两步转化：先在克隆菌里筛，再进表达菌

这一步的道理很多人知道但懒得做。DE3 菌里 T7 RNA 聚合酶本身有本底，质粒一转进去就开始漏表达，碰上毒性蛋白，细胞长得慢、质粒重排、克隆筛不出来，最后你拿到的阳性克隆已经不是原来那个东西。所以标准流程是两步走：先在不含 DE3 的克隆菌里完成连接、转化、酶切鉴定和测序，确认无误后再把纯质粒转进表达菌。

1. 连接产物转化克隆菌，加对应抗生素的平板，37 ℃ 过夜。
2. 挑单克隆摇菌提质粒，双酶切初筛，阳性送测序，逐碱基确认无移码无意外终止。
3. 取 1 μL 测序正确的质粒转化表达菌感受态，冰上 30 min、热激、复苏后涂板。
4. 挑单克隆接 3–5 mL 含抗生素的培养基，37 ℃ 过夜做种子。
5. 种子按 1:100 转接新鲜培养基，37 ℃ 摇到 OD600 0.6–0.8，先取一份未诱导样品，再加 IPTG。

两个容易忽略的点：倒平板时抗生素要等琼脂降到 50–55 ℃ 再加，温度高了氨苄直接失效；种子液一定用新鲜过夜培养、抗生素加足的单克隆，4 ℃ 放了几天的菌液再转接，质粒丢失比例高得离谱。

5. 避坑排查：五条从「没带」到「带不对」的现场记录

表达出问题，最怕上来就换载体换菌株，一顿操作把变量全改了。我的习惯是先按现象归类，再顺着因果链往回查。下面五条是这些年遇到频率最高的，按「现象 → 原因 → 解决」写。

5.1 现象：诱导前后跑胶都没带

原因通常有三层。最外层是根本没表达：质粒进了不带 DE3 的菌，没有 T7 RNA 聚合酶，T7 启动子永远是哑的。中间层是表达了但读不对：起始密码子和载体序列之间移码，或者引物漏了终止密码子、载体又不提供，翻译读到下游乱七八糟的序列。最里层是压根没质粒：克隆菌里筛到的阳性，转进表达菌后因为毒性被淘汰，挑到的克隆是空载或者重排质粒。

解决办法按顺序来：先拿测序结果和载体图谱做一次逐碱基比对，确认读码框和终止密码子；再取诱导前后的菌液各一份提质粒跑胶，看质粒还在不在、大小对不对；最后换一个明确带 DE3 的菌株重转。如果怀疑毒性，先在克隆菌里保存质粒，表达菌现转现用，别做过夜种子。

5.2 现象：条带比预期小一大截

这种「带不对」比「没带」更迷惑。常见原因有四个：一是稀有密码子造成的翻译提前终止或截短，尤其连续出现的时候；二是目的基因内部有和内切酶位点撞车的序列，克隆过程中被切掉一段；三是宿主蛋白酶把产物降解了，跑出来一片拖尾和小条带；四是 SDS-PAGE 本身的玄学——带电量高的蛋白结合 SDS 少，泳动受阻，富含脯氨酸的蛋白跑得特别慢，蛋白等电点在 5 到 9 之间且氨基酸组成没有明显偏好时，迁移率异常大概率不是胶的问题。

处理顺序：先用 N 端或 C 端标签抗体做 Western，看那条小带到底是不是你的蛋白降解产物；同时把测序结果丢进 4.1 的脚本里扫一遍内部位点和稀有密码子；确认降解明显就换蛋白酶缺陷更彻底的菌株，或者降温到 16–18 ℃ 表达。三条都排除了，就老老实实重新构建。

5.3 现象：表达量很高，但全在沉淀里

这是包涵体最典型的模样。根源是表达速度超过了折叠速度，尤其强启动子配 37 ℃ 配高浓度 IPTG 的组合，几乎必然翻车。另外含二硫键多的蛋白在细胞质的还原环境里本来就折不对。

解决思路是从快到慢一路降：先把温度降到 25 ℃ 甚至 16 ℃，IPTG 从 0.5–1 mM 降到 0.05–0.1 mM，同时把诱导时间拉长到过夜；还不行就换 gor/trxB 缺陷的菌株改善氧化环境，或者干脆换融合伴侣、加周质分泌信号肽。如果这个蛋白本来就是做抗原用，包涵体其实不算坏事——致密结构本身抗降解，产量还高，PBS 悬起来加佐剂直接免疫完全可行。真要拿活性蛋白，再走尿素溶解、变性纯化、复性那条路，但复性是整个流程里最磨人的环节，能绕就绕。

5.4 现象：不加 IPTG 也有明显条带，质粒越传越少

本底泄漏的典型表现。原因在 2.3 已经拆过：T7 RNA 聚合酶在非诱导条件下有痕量表达，碰上高拷贝质粒和强启动子，这点泄漏足以让毒性蛋白把细胞拖垮。

解法是叠加阀门：换带 T7lac 的载体，让 lacI 从两头压制；共转化低表达版本的溶菌酶辅助质粒；实在压不住就上低拷贝载体。要注意高表达版本的溶菌酶质粒虽然抑制更彻底，但宿主长得慢、诱导滞后，表达量反而可能掉下来，别一上来就选最狠的。另外培养基里加葡萄糖是流传很广的经验做法，效果因蛋白而异，值得试一次但不值得死磕。

5.5 现象：转化子长不出来，或者菌长得特别慢

先怀疑抗生素平板：温度太高倒板导致氨苄失效，或者抗生素加得过量。再怀疑感受态效率，尤其是大质粒，化转效率本来就低，换成电转会好不少。还有两个隐蔽原因：一是表达质粒和辅助质粒抗性冲突，比如两个都是氯霉素抗性，筛选压力互相抵消；二是用了抑制过强的宿主配置，比如高表达溶菌酶质粒，细胞本身状态就很差，涂板后长得稀稀拉拉。

处理办法：重新倒一批平板，抗生素现配现加；质粒大于 10 kb 的优先电转；抗性组合在选载体阶段就规划好，别等到转化才发现撞车；如果只是要保存质粒，先转克隆菌，表达菌现用现转。

6. 条件矩阵与验证闭环：从「有带」推到「有活性」

拿到一条带只是起点，真正决定这个蛋白能不能往下做的是可溶性比例和活性。我一般不会一次只做一管，而是上来就铺一个小矩阵，两三天内把温度和诱导剂这两条曲线摸完。

6.1 一个八管的温度乘 IPTG 矩阵

接种一份 OD600 到 0.6–0.8 的种子，分装到八支管里，按下面的组合走。所有样品统一取等 OD 的菌量，跑同一块胶。

跑胶的时候对照一定要齐：Marker 判大小，阳性标准品验证 Western 体系可靠，空载体诱导看宿主背景，重组载体不诱导看泄漏，再加不同诱导时间的取样看表达曲线。少一个对照，后面解释结果时就少一条退路。染色方面，考马斯亮蓝灵敏度在 100 ng 量级，够看主要条带但没法接着做 Western；银染能到 0.1–1 ng，代价是胶基本废掉；预算允许可以用荧光染料染，灵敏度高还能继续转膜。

6.2 上清与沉淀分流，把结论钉死

光看全菌胶分不清可溶和不溶。取等量菌液离心，重悬后冰浴超声破碎（或高压均质），离心留上清，沉淀用等体积缓冲液重悬，两者各取一样上样。目的带出现在上清，说明可溶，直接走亲和纯化；出现在沉淀，别急着上变性复性，先回头把矩阵里 16 ℃ 那两管的结果看一遍，很多时候降温和降 IPTG 就能把一部分蛋白拉回上清。

Western 这一步别省。抗 His 或者对应标签的抗体先确认那条带确实是你的蛋白，再谈产量和纯度。我见过不止一次「表达成功」的结论，最后发现那条带是宿主自身蛋白在同一个位置凑巧出现。把标签验证、上清沉淀分流、诱导时间曲线三件事做完，这个表达体系才算真正跑通，后面放大培养和纯化才有意义。

那次连续三周做不出带，最后发现是阳性克隆转进了不带 DE3 的菌里，我把所有条件都优化了一遍，就是没回去看宿主。从那以后我每次做表达前，都强制把序列体检脚本、宿主是否带 DE3、抗性组合这三件事各过一遍，哪怕只花半天。希望帮到你。

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