PCF80空间单细胞蛋白组：有效应对组织自发荧光挑战，保障多重空间蛋白组学检测质量

在组织原位空间蛋白组学技术的实际应用中，自发荧光是荧光成像检测中一个非常常见且棘手的问题，尤其对于脑组织、肝脏等富含脂褐素等内源性荧光物质的样本，以及经过福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）处理的样本，自发荧光现象往往更为严重。PCF80作为基于PhenoCycler-Fusion（PCF）技术的空间单细胞蛋白组检测方案，以80个蛋白标志物覆盖免疫、肿瘤、基质、血管、代谢及细胞命运等多个维度，不仅具备高重空间蛋白组学和超多重蛋白成像技术的核心优势，还针对自发荧光问题建立了系统性的应对策略，可帮助研究者在复杂样本条件下依然获得可靠的空间蛋白层面证据，为空间多组学研究提供高质量的数据支持。

一、自发荧光：空间蛋白组检测中的常见挑战

自发荧光是指生物组织中的某些内源性物质（如脂褐素、胶原蛋白、弹性蛋白等）在激发光照射下产生的非特异性荧光信号。这一问题在空间蛋白组检测中尤为突出，特别是在AF488和ATTO550等较短发射波长的荧光通道中，自发荧光背景会严重干扰目标蛋白信号的真实读取，降低信噪比，甚至掩盖低丰度蛋白的表达信息。

FFPE样本由于经过福尔马林固定和石蜡包埋处理，其自发荧光现象通常比新鲜冷冻（FF）样本更为严重。脑组织样本则因富含脂褐素等自发荧光物质，成为高自发荧光样本的典型代表。在阿尔茨海默病等神经退行性疾病研究中，老年脑组织的自发荧光问题尤为突出，给空间蛋白组检测带来了显著挑战。因此，如何有效降低或消除自发荧光干扰，是保障组织原位空间蛋白组学技术检测质量的关键环节之一。

二、荧光通道优化：从源头降低自发荧光干扰

PCF空间单细胞蛋白组技术通过优化荧光通道选择，从源头降低自发荧光对检测的影响。在自发荧光较高的FFPE样本中，可优先选择远红/近红外通道，如AF750等，用于降低短波长通道自发荧光背景对信号读取的影响。这一策略特别适合用于自发荧光较高的FFPE样本，可帮助研究者在保持检测灵敏度的同时，减少背景噪声对数据质量的负面影响。

对于高自发荧光的样本，PCF技术进一步建议使用较高发射波长的荧光基团检测低丰度蛋白标志物。例如，在FF样本中推荐使用Cy5通道检测低丰度蛋白，在FFPE样本中则推荐使用AF750通道。这种基于样本类型和蛋白丰度的差异化荧光通道配置策略，可帮助最大化检测信号的清晰度和可靠性，为后续的空间蛋白分析奠定坚实的数据基础。

三、预处理策略：淬灭试剂与自发荧光预评估

在正式开展PCF多轮循环检测前，对组织切片的自发荧光水平进行预先评估是保障检测质量的重要步骤。PCF空间单细胞蛋白组推荐在进行抗体验证或执行正式检测前，对同一连续组织切片进行预先的自发荧光检测，以全面评估样本的自发荧光水平和分布特征。基于预评估结果，可针对性地制定自发荧光消除方案。对于自发荧光较高的样本，PCF技术建议使用淬灭试剂预先处理组织切片，以达到消除或降低自发荧光的目的。

四、算法校正：多轮循环检测中的背景扣除机制

PCF空间单细胞蛋白组采用多轮循环成像流程，在数据分析阶段可结合背景信号评估、通道校正、阴性对照和质控流程，对自发荧光相关背景进行校正或扣除。该过程与荧光通道优化、样本预处理共同构成高自发荧光样本的质量控制策略。需要注意的是，自发荧光校正效果仍与样本类型、组织保存状态、目标蛋白丰度和通道配置相关，因此建议在正式检测前进行自发荧光预评估和抗体验证。

五、高自发荧光样本的典型应用场景与研究价值

在神经退行性疾病研究中，脑组织样本的自发荧光问题尤为突出。已有研究针对人脑FFPE样本优化了CODEX/PCF检测流程，并通过自发荧光降低策略和细胞分割流程，绘制了AD大脑中小胶质细胞的高分辨率空间图谱，鉴定出与淀粉样蛋白斑块紧密相关的特殊小胶质细胞状态。该案例说明，经过合理的样本预处理、通道配置和数据质控，PCF技术可用于高自发荧光脑组织的空间蛋白组学研究。

除神经科学领域外，PCF80同样适合用于肝脏、肠道等富含自发荧光物质的组织样本研究。在肿瘤免疫微环境、炎症性疾病和组织损伤修复等研究方向中，PCF80可帮助研究者系统解析细胞类型组成、功能状态、空间邻域关系和细胞互作网络，即使面对自发荧光较高的FFPE样本，也能提供可靠的空间蛋白组学数据支持。

从荧光通道优化、淬灭预处理到算法背景扣除，PCF80空间单细胞蛋白组技术建立了系统性的自发荧光应对策略，使其能够在高自发荧光样本条件下依然保持高维蛋白共检测的准确性和可靠性。无论是脑组织、FFPE样本还是其他复杂组织类型，PCF80都可帮助研究者克服自发荧光的技术障碍，充分释放空间蛋白组学在疾病机制研究和空间多组学整合中的应用潜力，为复杂组织微环境研究提供高质量的空间蛋白层面证据。